流式細胞儀的發(fā)展歷史及其原理與應(yīng)用進展

摘　要　流式細胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細胞術(shù),是用流式細胞儀(flow cytome-ter FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。它是眾多不同學術(shù)背景、不同科技領(lǐng)域相結(jié)合的結(jié)晶。它是物理學、生物學、醫(yī)學等綜合運用的產(chǎn)物。本文就流式細胞術(shù)的發(fā)展歷史、流式細胞儀的原理及在各領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述,闡明現(xiàn)代流式細胞術(shù)由于結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、定量熒光細胞化學技術(shù),使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領(lǐng)域中的應(yīng)用有更加突飛猛進的發(fā)展。

關(guān)鍵詞　流式細胞術(shù)(FCM) 　歷史　原理　應(yīng)用

流式細胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細胞術(shù),是用流式細胞儀(flow cytometer FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。它凝結(jié)眾多不同學術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域科學家的心血。從流式細胞術(shù)的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個領(lǐng)域應(yīng)用的拓展,每一步都是諸如電子技術(shù)、流體力學、計算機科學、激光技術(shù)、生物學、生物技術(shù)、高等數(shù)學、臨床醫(yī)學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結(jié)晶�，F(xiàn)代流式細胞術(shù)更是由于它結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、定量細胞化學技術(shù)和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領(lǐng)域中的應(yīng)用有更加突飛猛進的發(fā)展。流式細胞術(shù)的發(fā)展史也就是各個相關(guān)學科的發(fā)展史的縮影。

1 　流式細胞術(shù)的發(fā)展歷史

1930 年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細胞的計數(shù);1934 年,Moldaven 是世界上最早設(shè)想使細胞檢測自動化的人,他試圖用光電儀記錄流過1 根毛細管的細胞數(shù)量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術(shù);1940 年,Coons 提出用結(jié)合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數(shù)器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV) 和可見光光譜區(qū)檢測細胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理,成功地設(shè)計紅細胞光學自動計數(shù)器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數(shù)器裝置,成為流式細胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計數(shù)器;1959 年,B 型Coulter計數(shù)器問世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個設(shè)想:(1) 用分光光度計定量細胞成分; (2) 結(jié)合測量值對細胞進行分類; 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎(chǔ)上提出細胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM(即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計;1972 年,Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術(shù),為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)�，F(xiàn)今隨著光電技術(shù)的進一步發(fā)展,流式細胞儀已開始向模塊化發(fā)展,即它的光學系統(tǒng)、檢測器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實驗要求隨意更換。進入21 世紀,流式細胞術(shù)已經(jīng)日臻完善,成為分析細胞學領(lǐng)域中無可替代的重要工具。

2 　流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀主要由4 部分組成:液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室,用不含細胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液) 在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動,形成一個圓形的流束(即鞘流) ,待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域,經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,稱為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號基本上反映細胞體積的大小;90°散射光又稱側(cè)向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號強度可反映細胞部分結(jié)構(gòu)的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直,經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號,再通過模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機采集所測量到的各種信號進行計算處理,將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上,以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同而有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達,其x 軸為測量的散射光或熒光的強度(可以是線性軸,也可以選擇對數(shù)軸) ,縱軸為相對細胞數(shù)。一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有256 或1024 通道數(shù),這視其模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的散點圖、等高線圖或三維的立體視圖等。

流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取,它通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷,當帶電液滴通過電場,在電場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),然后落入相應(yīng)的收集器之中,從而實現(xiàn)細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000 個/ s 提高到現(xiàn)在的25000 個/ s。

流式細胞術(shù)發(fā)展趨勢可歸納為: ①流式細胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應(yīng)各種實際應(yīng)用的便攜式、臺式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細胞儀; ②對流式細胞術(shù)檢測熒光參數(shù),從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時檢測15 種熒光信號; ③從檢測參數(shù)的相對定量發(fā)展為絕對定量; ④從檢測參數(shù)的手動人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動分析; ⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識地學習上述各門學科知識,只有這樣才能更好地將流式細胞術(shù)應(yīng)用到生物醫(yī)學的臨床實踐和基礎(chǔ)科學研究工作中去。