結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域迎來“不結(jié)晶”革命

　　如果繼續(xù)發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問題都得到解決，冷凍電鏡確實會成為一種占據(jù)統(tǒng)治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇。

　　在英國劍橋市一座鋼結(jié)構(gòu)建筑深處的地下室里，一場大規(guī)模的“叛亂”正在上演。

　　一個約3米高的龐大金屬箱正通過消失在屋頂上的橙色粗電纜，靜悄悄地發(fā)射兆兆字節(jié)的數(shù)據(jù)。這是全球最先進(jìn)的冷凍電子顯微鏡之一：一臺利用電子束為冷凍的生物分子成像并揭秘其分子形狀的設(shè)備。英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實驗室(LMB)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Sjors Scheres像個矮子一樣站在這臺價值500萬英鎊(合770萬美元)的設(shè)備旁邊介紹說，這臺顯微鏡非常敏感，以至于一個叫喊聲就能毀掉試驗。

　　在全球?qū)嶒炇抑�，類似這樣的冷凍電鏡正影響著結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域。過去3年里，它們揭示了制造蛋白的核糖體細(xì)節(jié)，而這些發(fā)現(xiàn)正在以飛快的速度發(fā)表于頂級期刊。結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們毫不夸張地認(rèn)為，他們的領(lǐng)域正處于一場革命當(dāng)中：冷凍電鏡能快速創(chuàng)建那些抗拒X射線結(jié)晶學(xué)和其他方法的分子的高分辨率模型。與此同時，利用此前技術(shù)獲得諾貝爾獎的實驗室正爭先恐后地學(xué)習(xí)這種“新貴”方法。

　　挑戰(zhàn)“王者”

　　當(dāng)1973年生物學(xué)家Richard Henderson到LMB研究一種被稱為菌視紫紅質(zhì)的蛋白時，利用光能量推動質(zhì)子穿過細(xì)胞膜的X射線結(jié)晶學(xué)是毫無疑問的“王者”。Henderson和他的同事Nigel Unwin利用這種蛋白制成二維晶體，但它們并不適合X射線衍射。因此，兩人決定嘗試電子顯微鏡。

　　當(dāng)時，電子顯微鏡用于研究被重金屬染色劑處理過的病毒或組織切片。一束電子被射向樣品，其中掙脫開來的電子被探測到并用于描繪它們所撞入的材料結(jié)構(gòu)。這種方法產(chǎn)生了煙草病菌的首幅清晰圖像，但染色劑使觀察單個蛋白變得困難，更不用說X射線所能揭示的原子水平上的細(xì)節(jié)。

　　在一個關(guān)鍵步驟中，當(dāng)Henderson和 Unwin利用電子顯微鏡對菌視紫紅質(zhì)的晶片進(jìn)行成像時，他們省略了染色劑，相反把晶體放在金屬網(wǎng)格上，以便使蛋白凸顯出來�！澳隳芸吹降鞍字械脑�子。”和Unwin在1975年發(fā)表了菌視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的Henderson介紹說�！斑@是一個巨大的進(jìn)步�！泵绹�加州大學(xué)舊金山分校細(xì)胞生物學(xué)家David Agard表示，“這就是說，利用電子顯微鏡研究蛋白結(jié)構(gòu)將成為可能�！�

　　冷凍電鏡領(lǐng)域在上世紀(jì)八九十年代得到發(fā)展。一個關(guān)鍵進(jìn)步是將液態(tài)乙烷用于瞬間凍結(jié)溶液中的蛋白并使其保持靜止。不過，通常情況下，這種技術(shù)仍然只能將蛋白結(jié)構(gòu)解析到10埃(1埃相當(dāng)于1納米的十分之一)的分辨率——與X射線晶體學(xué)超過4埃的模型相比并沒有競爭力，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足將這些結(jié)構(gòu)用于藥物設(shè)計的要求。當(dāng)諸如美國國立衛(wèi)生研究院等資助者把上億美元投資到野心勃勃的晶體學(xué)項目時，對冷凍電鏡的資助遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于此。

　　1997年，當(dāng)Henderson參加關(guān)于3D電子顯微鏡的年度高登研究會議時，一位同事在開幕式上發(fā)表了頗有挑釁意味的聲明：冷凍電鏡是一種“小生境”方法，不可能取代X射線晶體學(xué)。不過，Henderson能看到一個不同的未來，并且在隨后的演講中進(jìn)行了反駁。“當(dāng)時我說，我們應(yīng)當(dāng)讓冷凍電鏡在全球統(tǒng)治所有結(jié)構(gòu)學(xué)方法�！彼�回憶道。

　　革命從此開始

　　此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實現(xiàn)了各種技術(shù)改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數(shù)碼相機(jī)風(fēng)靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專家仍然偏好過時的膠片，因為它能比數(shù)字傳感器更高效地記錄電子。不過，和顯微鏡生產(chǎn)廠商一道，研究人員開發(fā)出遠(yuǎn)超膠片和數(shù)碼相機(jī)探測器的新一代直接電子探測器。

　　這些從2012年左右獲得應(yīng)用的探測器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時，諸如Scheres等研究人員編寫了復(fù)雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉(zhuǎn)變成在很多情況下可與晶體學(xué)解析的分子圖像質(zhì)量相媲美的3D模型。

　　冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會四處晃動的穩(wěn)定、大型分子，因此通常由幾十個蛋白制成的分子機(jī)器是很好的目標(biāo)。而研究證明，沒有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過X射線晶體學(xué)解析核糖體結(jié)構(gòu)的方法，讓3位化學(xué)家獲得了2009年諾貝爾化學(xué)獎。過去幾年里，不同的研究團(tuán)隊迅速發(fā)表了來自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括首個人類核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎的Venki Ramakrishnan領(lǐng)導(dǎo)的LMB實驗室，X射線晶體學(xué)在很大程度上變得無人問津。他認(rèn)為，對于大型分子來說，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學(xué)技術(shù)的預(yù)測是可靠的”。

　　今年5月，加拿大多倫多大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家John Rubinstein和他的同事利用約10萬幅冷凍電鏡圖像，創(chuàng)建了一種名為V-ATPase、形狀類似轉(zhuǎn)子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過燃燒三磷酸腺苷(ATP)推動質(zhì)子進(jìn)出細(xì)胞液泡�！拔覀兛吹降氖且磺惺虑槎荚陟`活進(jìn)行�！盧ubinstein說，“它在彎曲、扭動和變形�！痹谒�看來，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。

　　統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域

　　像任何新興領(lǐng)域一樣，冷凍電鏡領(lǐng)域也有著成長的煩惱。一些專家擔(dān)心，競相利用此項技術(shù)的研究人員會產(chǎn)生有問題的結(jié)果。2013年發(fā)表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結(jié)構(gòu)，便受到科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認(rèn)為，用于構(gòu)建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團(tuán)隊產(chǎn)生的X射線和冷凍電鏡模型對原始模型提出了挑戰(zhàn)，但這些研究人員一直堅守他們的成果。

　　今年6月，在高登會議上，想要更多質(zhì)量控制的研究人員通過一項決議，督促各期刊為審稿人提供關(guān)于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)如何被創(chuàng)建的細(xì)節(jié)資料。

　　成本也會減緩此項技術(shù)的擴(kuò)散。據(jù)Scheres估算，LMB每天花費約3000英鎊運行其冷凍電鏡設(shè)備，還要加上1000英鎊的電費。大部分電費是由儲存和處理圖像所需的計算機(jī)產(chǎn)生的�！皩τ诤芏鄬嶒炇襾碚f，這是一項很高的開支�！�

　　為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預(yù)定時間的共享設(shè)備�；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所(HHMI)在其弗吉尼亞州珍利亞農(nóng)場校區(qū)運營著一個對HHMI資助的研究人員開放的冷凍電鏡實驗室。在英國，由政府和惠康基金會資助的一臺全國性冷凍電鏡設(shè)備，今年在牛津附近的迪德科特開始運行�！叭藗兿胍�了解冷凍電鏡，已成為當(dāng)下的一股浪潮�！睅椭�建立上述設(shè)備的倫敦大學(xué)伯克貝克學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Helen Saibil表示。

　　追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學(xué)生物物理學(xué)家Rod MacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結(jié)構(gòu)而共同分享了2003年諾貝爾化學(xué)獎，但如今卻在深入研究冷凍電鏡。“我正處在學(xué)習(xí)曲線的陡坡上，而這總是令我興奮不已�！盡acKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開和關(guān)閉的。

　　當(dāng)Henderson在1997年反駁說冷凍電鏡將統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)世界時，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預(yù)言已不像當(dāng)時看上去的那么夸張。“如果繼續(xù)發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問題都得到解決，冷凍電鏡確實會成為一種占據(jù)統(tǒng)治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇�！盚enderson說，“我們或許已經(jīng)成功了一半。”